反转录试剂盒(反转录)

吕宝寒
导读 大家好,乐天来为大家解答以下的问题,关于反转录试剂盒,反转录这个很多人还不知道,现在让我们一起来看看吧!1、你按照买的反转录试剂盒来

大家好,乐天来为大家解答以下的问题,关于反转录试剂盒,反转录这个很多人还不知道,现在让我们一起来看看吧!

1、你按照买的反转录试剂盒来做就行。

2、(1)、从细胞中提取细胞总RNA用GIBCO公司的Trizol试剂提取细胞总RNA。

3、按试剂使用说明操作:离心收集细胞,倾去细胞液,向沉淀中加1 ml Trizo1(每106-107细胞),混匀至室温5分钟,用1 ml加样器反复吹打,直至细胞完全裂解成均一溶液,不粘稠时为止。

4、随后加入200ul氯仿,剧烈振荡15秒钟,室温放置5分钟,然后,4 0C ,12000rpm离心5分钟,将上层水相转移至一Eppendorf管中,加入500ul异丙醇后混匀。

5、4 0C , 1 5000rpm离心15分钟,倾出异丙醇。

6、用70%乙醇洗涤沉淀一次,置冰上,让残余乙醇挥发殆尽。

7、溶于适量的DEPC水中,紫外分光仪测定RNA的纯度及含量,分装冻存于一700C保存.(2)、反转录成cDNA第一链(参照产品说明)在20ul体系中,加入1ug总RNA, 1 ul oligo dT12_l8 ( 500ug/ml ). RNase-Free水,70 0C温育10分钟后立即冰浴冷却,继续加入4ul 5 x Buffer, 2ul 0.1 M DTT, 1ul IOMm dNTPs ( IOMm/种),混匀后于42℃保温2分钟,加入1ul( 200U)的反转录酶,42℃继续温育50分钟。

8、700C 15分钟灭活反转录酶。

9、(3)、 引物设计(4)过程: 以1ulcDNA为模板,在50ul体系中含有Taq酶为2单位,dNTPs浓度为200uM,引物各为0.2uM。

10、扩增22个循环。

11、取8ul电泳。

本文分享完毕,希望对大家有所帮助。

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